현미경 관찰 (Microscopy)

현미경 관찰 (Microscopy)

 

최초의 현미경은 17세기에 세포와 단세포 유기체의 미세한 세계를 드러내는 데 사용되었다. 종종 현미경의 아버지라고 불리는 Robert Hooke와 Anton von Leeuwenhoek와 같은 과학적 개척자들은 다양한 살아있는 유기체의 세포 유형을 연구하기 위해 집에서 만든 현미경을 사용했다. 19세기 후반과 20세기 초반에 Santiago Ramón y Cajal은 조직학과 함께 현미경을 사용하여 신경계 구조에 대한 매우 상세하고 획기적인 연구를 수행했다.

현미경은 이제 신경과학에서 없어서는 안될 도구이다. 세포 소기관, 신경교 세포, 뉴런, 심지어 뉴런 집단까지도 육안으로 볼 수 없기 때문에 현미경은 세포 수준에서 신경계를 검사하는 데 필수적이다. 광학 현미경은 물체의 이미지를 정상보다 최대 1000배까지 확대할 수 있어 세포 구조와 국소 환경에 접근할 수 있다. 형광 현미경은 개별 세포내 구조를 강조하는 훨씬 더 큰 능력을 제공한다. 전자 현미경은 이론적으로 정상보다 100만 배 더 큰 이미지를 확대할 수 있어 시냅스, 표면 수용체 및 개별 단백질을 포함한 가장 작은 신경 구조에 대한 비할 데 없는 통찰력을 제공한다.

일반적인 형태의 현미경에 대한 기본적인 이해하는 것이 목표다. 먼저 광학 현미경의 기본 매개변수와 부품을 정의한다. 다음으로, 우리는 다양한 형태의 현미경 검사법과 조사자가 다른 형태보다 한 형태를 선택할 수 있는 이유를 조사한다. 마지막으로 현미경 데이터 처리 및 해석과 관련된 문제를 조사한다.

 

-매개변수에 영향을 미치는 현미경 부품뿐만 아니라 배율 및 분해능을 정의 - 표준 광학 현미경의 기본 부분과 이미지를 확대하기 위해 빛을 조작하는 방법을 설명 - 일반적인 형태의 현미경 검사법의 상대적 강점과 한계 비교

광학현미경 (Light microscopy): 명시야, 위상차, 암시야, 미분 간섭 대비 (DIC/Nomarski) 형광현미경 (Fluorescence microscopy): 표면형광, 공초점, 2광자 레이저 스캐닝 현미경, 내부 전반사 형광 (TIRF) 현미경 전자현미경 (Electron microscopy) : 투과전자현미경 (TEM), 주사전자현미경 (SEM), 전자단층촬영 (ET) 현미경 데이터 : 이미지 처리 및 해석

 

ESSENTIAL PRINCIPLES OF MICROSCOPY

현대 현미경은 의심할 여지 없이 몇 세기 전에 사용된 것보다 더 발전되었지만 현미경의 기본 부분과 함께 작동하는 원리는 본질적으로 동일하다. 다양한 형태의 현미경을 조사하기 전에 표준 광학 현미경의 기본 매개변수와 부품을 검토해야 한다.

Fundamental Parameters in Microscopy

현미경 검사에서 고려해야 할 두 가지 중요한 값이 있다. 배율과 해상도. 배율은 실제 크기에 비해 샘플이 얼마나 크게 나타나는지를 나타낸다.전체 뇌에서 개별 원자에 이르기까지 신경계 구성 요소의 상대적 크기를 보여준다. 육안으로는 크기가 약 0.2mm 이상인 물체를 감지할 수 있다. 따라서 전체 뇌와 큰 신경 구조를 볼 수 있지만 추가 확대 없이는 개별 뉴런이나 축삭을 볼 수 없다.

분해능 (또는 분해)은 두 점이 분리될 수 있지만 여전히 두 개의 개별 점으로 구별될 수 있는 최소 거리를 나타낸다. 예를 들어, 수천 개의 컬러 타일로 구성된 모자이크 이미지가 있는 건물의 측면을 보고 있다고 가정하면, 건물에서 한 블록 떨어진 곳에 서 있으면 전체 이미지를 볼 수 있지만 해상도가 너무 낮아 세부 수준을 볼 수 없기 때문에 개별 타일 자체를 식별할 수 없다. 가까이 다가가면 해상도가 더 좋아지고 이미지를 구성하는 개별 타일을 볼 수 있다. 마찬가지로 현미경에서는 두 구조를 서로 분리된 것으로 인식하기 어려울 수 있다. 분해능을 높여야 표본에서 뚜렷한 지점을 식별할 수 있다. 그림은 육안으로 확인할 수 있는 물체의 범위와 빛과 전자 현미경 (EM)이 제공하는 향상된 분해능을 보여주며 일반적으로 연구되는 신경 구조의 분해능을 나타낸다.

 

현미경의 분해능은 물체를 확대하는 현미경의 능력에 따라 결정되는 것처럼 보이지만 사실은 그렇지 않다. 물체를 확대한다고 해서 반드시 최종 이미지의 선명도나 해상도가 향상되는 것은 아니다. 확대된 물체의 해상도는 개구수와 광원의 파장이라는 두 가지 요소에 따라 달라집니다. 개구수 (NA)는 표본에서 빛을 모으고 초점을 맞추는 렌즈인 현미경 대물렌즈의 집광 능력을 측정한 것이다. NA가 높은 대물렌즈는 더 많은 광선을 수집하여 더 나은 분해능으로 이어진다. 대물렌즈의 NA는 빛이 대물렌즈에 들어가는 각도와 대물렌즈가 작동하는 매질의 굴절률에 따라 달라진다. 굴절률 (또는 굴절)은 특정 매질 (공기의 경우 1.0, 물의 경우 1.33, 기름의 경우 최대 1.55)을 통과하는 빛의 속도 변화를 나타낸다. 굴절률이 클수록 NA가 커진다. 빛이 하나의 매질 (ex. 공기)에서 굴절률이 더 높은 매질 (ex. 오일)로 이동함에 따라 빛의 각도가 변경되어 대물렌즈가 더 많은 빛을 모을 수 있다. 이것은 물 한 컵의 빨대가 물 표면에서 구부러진 것처럼 보이게 하는 것과 같은 원리이다. 기름에 잠긴 대물렌즈는 공기 중의 대물렌즈보다 NA가 높기 때문에 기름에 잠긴 대물렌즈는 해상력이 더 크다.

 

확대된 물체의 해상도를 결정하는 또 다른 요소는 표본에서 조명하거나 방출하는 빛의 파장이다. 광학현미경에서 빛은 표본을 비춘다. 형광 현미경에서 빛은 표본에서 나온다. 파장은 광파의 두 반복 단위 사이의 거리이다 (그림 A). 파장이 다른 광선은 사람의 눈에 다른 색상으로 나타난다 (그림 B). 빛의 파장은 빛의 단일 지점이 얼마나 넓게 나타나는지에 영향을 준다. 더 짧은 파장의 빛 (UV-녹색)은 더 긴 파장 (적외선-적외선)보다 더 선명하게 나타나며 더 넓게 퍼져서 분해능이 감소하는 경향이 있다.

따라서, 현미경이 표시할 수 있는 가장 작은 물체는 표본을 이미지화하는 데 사용되는 배율과 분해능의 함수이다. 흥미롭게도 물체를 확대하는 현미경의 능력은 본질적으로 무제한이지만 해상도는 유한하다. 광학 현미경은 배율에 상관없이 신경 시냅스 크기인 0.2μm보다 작은 표본의 세부 사항을 분해할 수 없다. 이 제한은 가시광선의 최소 파장 때문이다. 스펙트럼의 녹색 부분에서 UV보다 짧은 파장은 사람의 눈에는 보이지 않는다. 이 제한으로 인해 광학 현미경의 분해능이 최대값을 갖게 된다. 맨눈으로 볼 수 있는 사람의 눈은 0.2mm 크기로 세부 사항을 볼 수 있다. 광학 현미경은 약 0.2μm의 세부 사항만 분해할 수 있으므로 이러한 세부 사항을 1000배 (1000 × 0.2μm = 200μm = 0.2mm) 이상 확대하는 것은 유용하지 않다. 배율을 1000배 이상으로 늘리는 것은 컴퓨터의 줌 기능을 사용하여 고정된 크기의 디지털 사진을 확대하는 것과 같다. 디지털 줌으로는 더 미세한 세부 사항을 얻을 수 없다. 단순히 픽셀을 더 크게 만들기만 하면 된다. 그러나 EM과 같이 가시 광선을 사용하여 표본을 이미징하지 않는 기술은 훨씬 더 높은 분해능을 가질 수 있으며 광학 현미경보다 훨씬 작은 구조를 이미징할 수 있다.

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780128005118000058

Microscopy