형광 현미경 (Fluorescence microscopy)

형광 현미경 (Fluorescence microscopy)

 

 

형광 현미경은 특정 파장에서 빛을 흡수한 다음 다른 (일반적으로 더 긴) 파장에서 빛을 방출하는 특성을 가진 형광단이라고 하는 특수 분자를 활용한다. 청색광을 흡수하는 형광단은 일반적으로 녹색광을 방출한다. 녹색 빛을 흡수하는 형광단은 빨간색을 방출한다. 적색을 흡수하는 형광단은 적외선을 방출한다. 상업적으로 이용 가능하고 일반적으로 사용되는 수십 개의 형광단 분자가 있으며 각각 고유한 흡수 (excitation) 및 방출 파장이 있다 (그림 C). 이러한 분자는 항체 또는 기타 분자 프로브에 연결되어 세포 내의 특정 단백질, 세포 소기관 또는 기타 구조의 존재를 나타낼 수 있다.

 

형광 현미경의 주요 용도는 이러한 형광 시약으로 표지되거나 유전적으로 암호화된 형광 단백질을 발현하는 표본을 검사하는 것이다. 매우 밝은 광원의 빛은 특정 파장 범위의 빛만 대물 렌즈를 통해 표본을 비추도록 허용하는 여기 필터를 통과한다. 그 빛은 더 긴 파장의 빛을 방출함으로써 반응하는 표본의 형광단에 의해 흡수되고 여기된다. 방출된 빛은 대물 렌즈를 통해 다시 수집되고 두 번째 필터인 방출 필터를 통과한다. 방출 필터는 표본을 비추는 데 사용되는 빛을 포함하여 외부 파장의 빛을 차단하지만 방출된 빛 파장은 감지기 (ex. 눈 또는 카메라)로 통과할 수 있다. 광학 필터는 형광단으로 태그가 지정된 구조가 어두운 배경에서 빛나는 것처럼 보이게 한다. 배경이 어둡기 때문에 빛나는 형광 시약의 소량이라도 볼 수 있으므로 형광 현미경 검사는 매우 민감한 기술이다.

 

기존의 광학 현미경에 비해 형광 현미경의 주요 매력은 세포 내의 구조와 단백질이 광범위한 형광단으로 표지될 수 있다는 것이다. 각 형광단은 고유한 여기 및 방출 스펙트럼 (흡수 및 방출하는 빛의 파장)을 가지고 있기 때문에 동일한 샘플에서 다른 구조에 레이블을 지정하고 상대적 위치를 조사할 수 있다. 예를 들어, 조사자는 스펙트럼의 녹색 범위에서 빛을 방출하는 형광단을 사용하여 한 단백질에 레이블을 지정하고 스펙트럼의 빨간색 범위에서 빛을 방출하는 형광단을 사용하여 다른 단백질에 레이블을 지정할 수 있다. 녹색 및 적색 형광단의 여기 및 방출 스펙트럼이 겹치지 않기 때문에 동일한 샘플 내에서 이러한 서로 다른 단백질의 위치를 뚜렷하게 표시한다. 이 기술은 살아있는 표본에서도 형광 표지된 여러 단백질과 분자의 동적 상호 작용을 관찰하는 데 사용할 수 있다.

 

형광 현미경의 장점에도 불구하고 몇 가지 단점이 있다. 한 가지 주요 제한 사항은 형광 시약이 무기한 조명될 수 없다는 것이다. 형광단에서 방출되는 빛의 강도는 시간이 지남에 따라 지속적으로 빛에 노출됨에 따라 감소하는데, 이를 광표백 (photobleaching)이라고 한다. 따라서 형광 태그가 지정된 표본의 빛 노출을 제한하고 형광이 너무 흐려지기 전에 이미지를 캡처해야 한다. live 세포 이미징의 또 다른 한계는 광독성 (phototoxicity)으로, 조명이 자유 라디칼 생성으로 인해 형광단을 발현하는 세포의 죽음으로 이어진다. 마지막으로, 형광 표지된 구조는 쉽게 감지할 수 있지만 실제로는 배경 노이즈가 실제 관심 신호를 가릴 수 있다. 배경 잡음은 진정한 특정 신호를 나타내지 않는 비특이적 형광이다. 배경의 한 형태는 특정 구조, 화학 물질 및 유기체가 형광단 라벨을 추가하지 않고도 자연적으로 형광을 내는 자가형광일 수 있다. 이 형광이 형광 라벨과 동일한 방출 파장을 갖는다면 noise로부터 진정한 신호를 결정하기 어려울 수 있다.

 

형광단은 신경과학의 모든 영역을 발전시켰다. 형광 분자는 신경 구조와 기능을 연구하고, 세포 내 단백질의 공간적 관계를 확인하고, 신경 구조의 미세 분기를 조사하고, 화학적 또는 전기적 자극에 대한 세포의 기능적 반응의 시간 경과를 자세히 설명하는 데 획기적인 발전을 이루었다. 다양한 형태의 현미경은 형광 시약의 장점을 최대화하고 단점을 최소화하려고 시도한다.

 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780128005118000058

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