이광자 현미경 (Two-Photon Microscopy)

이광자 현미경 (Two-Photon Microscopy)

 

 

2광자 레이저 스캐닝 현미경이라고도 하는 정밀 형광 현미경을 더욱 개선한 것이다. epifluorescent 또는 confocal microscopy에서 특정 파장의 빛의 단일 광자는 형광단을 여기시켜 빛을 방출한다. 2광자 현미경에서 형광단은 2개의 광자를 동시에 효과적으로 흡수함으로써 여기될 수 있다. 이 경우 각 광자는 자체적으로 일반적인 여기 (excitation) 파장의 2배인 파장을 가지므로 광자당 에너지 준위가 절반이다. 형광단이 두 개의 저에너지 광자를 동시에 흡수할 때 각각은 더 많은 에너지와 더 짧은 파장을 가진 단일 광자가 형광단과 상호작용하는 데 필요한 여기 에너지의 절반을 제공한다.

 

주요 장점은 두 광자의 거의 동시 도달이 극히 드문 경우이므로 형광 여기가 표본 내의 좁은 초점 평면으로 제한된다는 것이다. 이는 광자가 초점 평면에 위치한 여기된 형광단에서만 방출되기 때문에 상대적으로 적은 수의 형광단이 존재하는 경우에도 기존 공초점 현미경보다 선명한 이미지를 제공한다. 따라서 모든 방출된 빛을 수집할 수 있다. 배경 형광을 생성하기 위해 초점 평면 위와 아래에 위치한 형광단을 여기시키기에 충분한 에너지가 없다.

 

2광자 현미경은 여기 파장이 사용되는 일반적인 파장의 약 2배이기 때문에 공초점 또는 표면형광 현미경보다 조직 (500μm-1mm) 깊숙이 침투할 수 있다. 파장이 긴 빛은 산란이 적어 조직에 더 깊이 침투할 수 있다. 여기가 초점으로 제한되어 있기 때문에 광표백 및 광독성이 적어 2광자 현미경이 전체 동물의 해부되지 않은 살아있는 뇌 조직의 세포 또는 뇌 조각의 미세 규모 신경 구조의 확장된 관찰에 특히 유용하다. 이 방법의 주요 제한 사항은 2광자 현미경 설정에 고가의 특수 레이저 및 장비가 필요하다는 것이다.